(―)原理
蛋白质分子是典型的两性电解质分子，它在大于其等电点的pH环境中解离成带负 电荷的阴离子向电场的正极泳动，在小于其等电点的pH环境中解离成带正电荷的阳离 子向电场的负极泳动。这种泳动只有在等于其等电点的pH环境中，即蛋白质所带的静电 荷为零时才能停止。如果在一个PH梯度的环境中将含有各种不同等电点的蛋白质混合 样品进行电泳，那么在电场作用下，不管这一大群混杂的蛋白质分子原始分布如何，各蛋 白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度中相对应的位置进行聚集，经过一定 时间以后，不同的蛋白质组分便分隔在不同的区域之中，这种按等电点的大小在PH梯度 某一相应位置进行聚集的行为叫做聚焦。等电聚焦是一种特殊的电泳方法，其特殊之处就 在于它利用了一种称为两性电解质原载体的物质在电场中构成连续的pH梯度，使蛋白 质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦，从而达到离析目的。
所谓两性电解质载体，实际上是许多异构体和同系物的混合物，其化学本质都是多羧 基多氨基脂肪族化合物，分子量在300〜400之间，商品名有“Ampholine”(瑞典LKB公 司产品）、“Pharmalyte”(瑞典Pharmacia公司产品）等。它们在直流电场的作用下，能从正 极到负极形成一个pH值逐渐升高的平滑连续的pH梯度。这种pH梯度的稳定程度如何 对两性电解质的聚焦影响极大。在聚焦过程中，扩散是一种起破坏作用的因素，特别是外 加电场撤销以后，它能使两性电解质载体所构成的pH梯度遭到破坏，使因聚焦而被分离 的样品组分又重新混合。要消除这一破坏因素需要加入抗对流的支持介质。最常用的抗 对流支持介质是聚丙烯酰胺凝胶。
凝胶等电聚焦一般就是指用聚丙烯酰胺凝胶作抗对流支持介质的等电聚焦。这种电 泳方法的特点是两性电解质载体因受直流电场作用而在凝胶柱或凝胶板内产生pH梯 度。如果是在凝胶柱内产生PH梯度，那么当蛋白质样品电泳到达这种凝胶柱的某一部 位，且此部位的pH值正好相当于该蛋白质等电点时便聚焦形成一条蛋白质区带。只要测 得聚焦部位的PH值就可知该蛋白质的等电点。
由于凝胶等电聚焦法消除了扩散作用的影响，延长电泳时间使所测物质更集中，区带 更狭窄，因而提高.了分辨率。这与一般电泳法因受扩散作用影响，随着电泳时间延长区带 愈来愈宽的情况相比，是一个很大的优点。应用凝胶等电聚焦法不仅能测定两性电解质的 等电点，而且能将具有不同等电点的混合物质进行分离或鉴定。
(二）操作方法
主要仪器双通玻璃管（内径0. 6cm，长10cm)8支;制胶玻管架;50M1微量进样器 1支;7号注射针头(长4cm)l支;10cm长注射针头1支;分析天平；电泳仪（300V);台灯； 圆盘电泳槽;鸭嘴形镊子(夹片用）1把;镊子1把;胶柱托板(黑色）1块。
材料胰凝乳蛋白酶（生化试剂，上海生物化学研究所产品），测定时必须配成 10mg/ml的水溶液。试剂
15%(W/V)凝胶贮备液（15%丙烯酰胺-0.4%甲撑双丙烯酰胺溶液）：称取15g 丙烯酰胺，0.4g N, N'-甲撑双丙烯酰胺溶于蒸馏水并定溶至100ml，滤去不溶物后置棕 色瓶内放冰箱贮存备用。
0. 004%(W/V)核黄素溶液:称取4mg核黄素（又称维生素B2，生化试剂），溶于 100ml蒸馏水，置棕色瓶内。临用前配制。
10%(W/V)TEMED溶液:取10mgTEMED，加蒸馏水90ml，置棕色瓶内，放冰 箱贮存。
1%(W/V)TEMED溶液：取10ml 10%TEMED溶液加蒸馏水90ml，置棕色瓶 内，放冰箱贮存。
5% (W/V)过硫酸铵溶液:临用前配制。
两性电解质载体:Ampholine(pH3. 5〜10)，含量40%(瑞典LKB产品），贮放冰 箱内。
0. 01mol/LH3PO4 溶液。
0. 02mol/L NaOH 溶液。
10%(W/V)三氯乙酸溶液。
操作步骤
聚焦凝胶柱的制备:首先是配胶。在25ml烧杯内，按下列配方各配制10ml凝胶液：
光聚合凝胶液配方:15%凝胶贮备液5ml，40%Ampholine0. 5ml，1 %TEMED溶液 0. 5ml,蒸馏水1. 5ml，0. 004%核黄素溶液2. 5ml。
化学聚合凝胶液配方凝胶贮备液5ml，40%Ampholine0. 5ml，10%TEMED溶液lml，蒸馏水3. 4ml,5%过硫酸铵溶液0. lmK最后加入）。
以上两种凝胶液配齐后分别用玻棒轻轻搅动使混合均匀。由于化学聚合的速度较快， 所以当5%过硫酸铵加入并用玻棒快速而轻轻搅匀以后，必须立即准备装管(注：为了去 除抑制聚合的氧气，较好在灯泡瓶内配胶，并进行减压抽气处理。对于化学聚合凝胶液，则 需在5%过硫酸铵加入以前进行减压抽气处理。本实验将此步省略并不影响实验效果）。
其次，装管和加样。将洗液处理过的干燥洁净的双通玻璃管（内径0. 6cm,长10cm)8 支，垂直插在制胶玻管架上，玻璃管的底端必须紧紧与橡皮塞相贴以保证底端封闭。8支 玻璃管分为两组，其中4支装光聚合凝胶液，4支装化学聚合凝胶液。用滴管取凝胶液沿 玻璃管内壁缓缓加入。每支玻璃管的凝胶液当加到接近管长的1/2时，用微量进样器加入 蛋白质样品液(胰凝乳蛋白酶的水溶液，其浓度为10mg/ml)，每支化学聚合凝胶管加样 304,每支光聚合凝胶管加样404。加样以后继续滴加凝胶液，直至离玻璃管上端lcm处 (胶长达9cm)为止。每支玻璃管在样品和凝胶液加完以后要进行水封。水封时，用一注射 器通过注射针头将蒸馏水沿玻璃管内壁缓缓加入，注意不要搅动凝胶液以保证凝胶的正 常聚合并形成平坦的表面。
再次，聚合。①将4支装有光聚合凝胶液的玻璃管在常温、垂直条件下用40W台灯光 照聚合约1. 5min。②将4支装有化学聚合凝胶液的玻璃管在常温、垂直条件下静置聚合 约 20min。
电泳:将凝胶管的水封端向上，垂直插入圆盘电泳槽装置内，下槽加0. 02mol/L NaOH溶液，轻轻敲动凝胶管以除去NaOH溶液与凝胶界面之间的气泡。用滤纸条吸除 凝胶管上端的水封层后，上槽加0. Olmol/L磷酸溶液，使凝胶管上端的空隙内完全充满 磷酸溶液，如有气泡须用针头或玻棒轻轻挑除。两组凝胶管要作好标记以便区别。
上槽接正极，下槽接负极。打开直流电源，恒压160V，聚焦约7h。当电流接近零时即 停止电泳。
剥胶:聚焦以后取下凝胶管,先用蒸馏水将凝胶管两端洗3次，再用带有长针头的 注射器内装蒸馏水进行剥胶。操作同聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。以凝胶柱的正极端为 “头”，负极端为“尾”，在“尾”部插上塑料三角标签。三角标签应预先编上号码，使光聚合凝 胶柱同化学聚合凝胶柱相区别。若凝胶柱的正极端和负极端不易分清，可用pH试纸检 定，酸性端是正极端，碱性端是负极端。
量出固定前的凝胶柱长度:将凝胶柱平放于胶柱托板(黑色)±.用尺量出每一根 凝胶柱的长度，并记录下来。
固定:每组凝胶柱各取3根，即光聚合凝胶柱取3根，化学聚合凝胶柱取3根，分 别置于培养皿内，加入10%三氯乙酸溶液直至将凝胶柱盖没，固定过夜。一般在2h以后 即可看见凝胶柱内蛋白质白色沉淀区带。
测定pH梯度:取试管架2只，每只试管架上各插上18支试管，每支试管内加入 lml蒸馏水。将未经三氯乙酸溶液固定过的光聚合凝胶柱1根平放在玻璃板上，按照从正 极端(酸性端)到负极端(碱性端)的顺序用刀片依次切成5mm长的小段，共18段,分别置 于 第一组试管架上的18支装有lml蒸馏水的试管中，浸泡过夜。将另一根未经三氯乙酸 溶液固定过的化学聚合凝胶柱作同样的处理，并将所切成的18段分别置于 第二组试管架
上的18支装有lml蒸馏水的试管中浸泡过夜。
次日用pH试纸测出每一支试管内浸泡液的pH值，并按照每一组试管的顺序记录下 来。
量出固定后的凝胶柱长度和聚焦部位至正极端的距离;将固定过的凝胶柱平放于 胶柱托板(黑色)上，用尺量出凝胶柱的长度以及凝胶柱的正极端（酸性端)到蛋白质白色 沉淀区带中心即聚焦部位的距离，记录下来。
(三）数据处理
pH梯度曲线的制作以凝胶柱长度(mm)为横坐标，pH值为纵坐标作图可得到 一条pH梯度曲线。由于所测得的每一管的pH值是以5mm长为一小段的pH混合平均 值，因此在作图时可以把这个pH值视为5mm小段中心区的pH值，于是 第一小段的pH 值所对应的凝胶柱长度应为2. 5mm， 第二小段的pH值所对应的凝胶柱长度为 (5X2 —2. 5)mm,由此类推， 第n小段的pH值所对应的凝胶柱长度为（5n — 2. 5)mm。
蛋白质样品等电点的求算
按下列公式计算蛋白质聚焦部位距凝胶柱正极端(酸性端）的实际长度（以心表示）：
Lp = Lp' X
式中，LV表示所量出的蛋白质白色沉淀区带中心距凝胶柱正极端的长度，L表示凝 胶柱固定前的长度，"表示凝胶柱固定后的长度。
根据蛋白质聚焦部位距凝胶柱正极端的实际长度/w>，从pH梯度曲线上查得的 某一 pH值就是该蛋白质的等电点。
试比较用光聚合凝胶柱和化学聚合凝胶柱进行聚焦所测定出的等电点值。
