从生物进化的观点来看，毒 蛇的毒素是为了适应更有效地捕食活动而发展起来的有毒物质，使被咬对象出现中毒症 状，有利于毒蛇的捕食。被咬对象产生的一系列中毒现象是毒理学研究的范畴。
最早弄清的蛇毒有毒成分是酶，例如:鱗脂酶八2能引起强烈的溶血作用，所以大多 数研究者着重研究与酶活性有关的毒性组分。近年来由于生物化学分离技术的飞速发展， 使人们了解到蛇毒中除某些酶类可以产生中毒症状外，蛇毒中还存在着高毒性的多肽类 毒素，而这些毒素并不具有酶的催化活性。在蛇咬伤致死的诸因素中，这类毒素的毒性远 远超过酶类引起的中毒性状，因此，蛇毒中的毒素组分就成为当前生物化学家、医学家、毒 理学家和许多研究者的热门课题，至今已弄清了许多种蛇毒中的这类毒素的化学结构和 性质，以及它们的毒理学性质等。
和蛇毒中的酶类一样，高毒性的多肽类毒素从化学性质来说，也就是一类分子量较小 的蛋白质。所以要鉴定它们，只能依靠其特殊的生物活性，即毒性试验来确定。生物学活 性的鉴定方法，包括整体动物法、离体器官法和试管试验法等。实验室常用的动物包括小 白鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、猫、狗等。离体器官也可用于生物活性的测试，例如蛙或兔的心 脏、豚鼠的回肠或子宫等,在一定的实验装置里，也可用于生物活性的测试。试管法则常用 于血液和某些离体组织的细胞悬液等。生物学活性的鉴定因存在着动物本身的个体差异， 所以实验中常须注意应有足够数量的动物，严格控制实验的条件和环境，然后对实验结果 作正确的统计分析。
一、氧化还原酶
(一）L-氨基酸氧化酶
有多种方法可以用来测定L-氨基酸氧化酶的酶活。主要有Wellner和Lichtenberg 法(1971)、奈氏法(1976)、经典的压力法、比色法与Holme和Goldberg法。下面介绍前两 种常用的方法。
方法一（Wellner 和 Lichtenberg 法，1971)
原理:苯丙氨酸能被L-氨基酸氧化酶脱氨生成苯丙酮酸，它的烯醇式可以与硼酸盐反应生成一种在300nm处有强吸收峰的复合物。为了防止生成的苯丙酮酸被氧化，反应 体系中加入过氧化氢酶分解在反应中生成的Hz02。
试剂：0. 4mol/L Tris-HCl缓冲液，如在37€恻试，缓冲液的pH为7. 5,如在25'C测 试，缓冲液的pH为7. 8;1 200IU/ml的过氧化氢酶液;0. 04mol/L L-苯丙氨酸;25%的三 氯乙酸(TCA);硼酸-砷酸盐溶液，最终含lmol/L砷酸钠和lmol/L硼酸，用浓HC1调 pH至6. 5,如有沉淀可过滤一次。
操作过程:在18mmX150mm的试管内加80/umol/L Tris-HCl缓冲液，60IU过氧化 氢酶,2IU〜30IUL-氨基酸氧化酶，总体积为0. 7ml。加0. lml 0. 04m0l/L L-苯丙氨酸后 立即放入37°C的水浴中，反应液在每分钟摇动200次的条件下反应15min,加0. 2ml 25% 的三氯醋酸终止反应。反应液转移到离心管中离心，取0. 5ml上清液与2. 5ml硼酸-砷酸 盐溶液混合，在室温(22‘C〜26€)放置30min以上。用不含酶的溶液为对照在300nm处 测定吸收值，反应液一般在数小时内稳定。
酶活力单位的规定:规定在上述条件下引起0. D. 300nm吸收值增加0. 03的酶活为 1个酶活力单位。这个单位相当于早先利用L-亮氨酸作底物，用压力计测定30min内吸 收1W氧气所需要的酶活力。
方法二(奈氏法，昆明动物所四室，1976)
L-氨基酸氧化酶活力采用奈氏试剂测定游离氨法进行测定。反应体系组成如下： 8mg/ml 蛇毒溶液配在 pH7. 6，0. lmol/L Tris-HCl 缓冲液 0. 2ml 中，0. lmol/L L-亮氨酸 (用上述缓冲液配制）lml，反应总体积1. 2ml。在37 C保温2h，加27%三氯乙酸lml停止 反应，放置20min后过滤，取lml滤液加lml蒸溜水和3ml奈氏试剂应用液，在430nm处 比色，测定氨的生成。
(二）乳酸脱氢酶
乳酸脱氢酶的测定方法很多，根据酶作用的反应可分为两大类:一类利用顺向反应， 以乳酸钠为底物；另一类利用逆向反应，以丙酮酸为底物。目前较多使用的是以乳酸钠为 底物的方法，因为此法所需的氧化型辅酶I较稳定，且价格便宜，而用丙酮酸为底物的方 法需用的还原型辅酶I很不稳定。此外，乳酸钠底物溶液也比丙酮酸底物溶液稳定，在室 温中可存放1个月，根据测定方法不同又可分为分光光度法和比色法。由于分光光度法需 用紫外分光光度计，目前多采用比色法。
近年来有人利用顺向反应形式的还原型辅酶I可以还原某些染料，如碘硝四唑蓝 (INT)、氯化硝基四氮唑蓝(NBT)，建立了另一种类型的呈色反应，并以吩嗪二甲酯硫酸 盐(PMS)作为还原型辅酶I和染料之间的递氢体。此法快速，操作简单，重复性较好。
方法一(乳酸脱氢酶比色测定法）
原理:乳酸脱氢酶在有辅酶I携氢的情况下，使乳酸脱氢生成丙酮酸。丙酮酸与2,4- 二硝基苯肼作用，生成丙酮酸苯腙。苯腙在碱性溶液中显红棕色，其显色的深浅与丙酮酸 的浓度成正比，与同样处理的丙酮酸标准液进行比色，求得乳酸脱氢酶的活力单位。
试剂：
0. lml甘氨酸溶液：称取甘氨酸7. 505g，氯化钠5. 85g,蒸馏水溶解后稀释到 1 000ml。
pH10. 0乳酸钠缓冲底物液：吸取70%乳酸钠溶液10ml，0. lmol/L甘氨酸溶液 125ml,0. lmol/L氢氧化钠75ml，混和，加氯仿数滴防腐，置冰箱保存。
辅酶I溶液:称取辅酶I (NAD+)10mg，加蒸馏水2ml，溶解后置冰箱保存，约可 用6周。
2,4-二硝基苯肼溶液:称取2,4-二硝基苯肼19. 8mg,用10m0l/L HC1 10ml溶解 后，加蒸馏水至100ml，置棕色瓶内，冰箱保存。
0. 4mol/L氢氧化钠溶液。
丙酮酸标准液（lnmol/L):准确称取纯丙酮酸钠11. Omg,置于100ml容量瓶中， 加入乳酸钠缓冲底物使其溶解并稀释至刻度。此液应新鲜配制。
操作:按表3-14-1进行操作。
表3-14-1 乳酸脱氢酶比色测定法操作步骤
|
加入物(ml) |
测定管 |
对照管 |
|
稀释蛇毒液 |
0. 1 |
0. 1 |
|
乳酸钠缓冲底物液 |
1. 0 |
1.0 |
|
辅酶I溶液 蒸馏水 |
0. 2 |
0. 2 |
|
混匀，置37'c水浴保温15min |
||
|
2,4-二硝基苯肼 |
1.0 |
1.0 |
|
混匀，置37'C水浴保温15min |
||
|
0. 4mol/L氢氧化钠 |
10. 0 |
10.0 |
混匀，室温放5mm，用440nm或蓝色滤光板进行比色，以蒸馏水调零，读取各管吸光 度读数,以测定管吸光度减去对照管吸光度，于标准曲线上查其活力单位值。
标准曲线绘制:见表3-14-2。
表3-14-2 乳酸脱氢酶比色测定法标准曲线绘制操作步骤
管 号
|
加入物(ml) |
0 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
|
丙酮酸标准液 |
— |
0. 05 |
0.1 |
0. 2 |
0. 3 |
0.4 |
0. 5 |
|
缓冲底物液(lnmol/L) |
1.0 |
0. 95 |
0. 9 |
0.8 |
0.7 |
0. 6 |
0. 5 |
|
蒸馏水 |
0. 3 |
0. 3 |
0. 3 |
0. 3 |
0. 3 |
0. 3 |
0. 3 |
|
2,4-二硝基苯肼 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1. 0 |
1. 0 |
|
置37’C水浴保温15min |
||||
|
0. 4mol/L氢氧化钠 |
10.0 |
10. 0 |
10. 0 |
10.0 10.0 10.0 10.0 |
|
|
0 |
250 |
500 |
1 000 1 500 2 000 2 500 |
混匀，室温放5min，用440nm或蓝色滤光板进行比色，以蒸馏水调零，读取各管吸光 度读数。将各管吸光度读数减去0号管读数后，与其相应的酶活力单位值在坐标纸上作 图，绘成曲线。
单位定义:以100ml标本在37°C与底物作用15min，生成1/xmol丙酮酸为1个乳酸 脱氢酶活力单位。
2.方法二(乳酸脱氢酶的定位染色）
按Rosalki法(1974)将完成电泳的凝胶浸入酶底物显色液(0. 036mmol/L磷酸盐缓 冲液、pH7.4 0.04g/L N-甲基酚嗪硫酸盐、0.74g/L硝基四氮唑蓝、0.50g/L NAD+、
0.356mol/L乳酸钠），37€避光保温30mm〜60min，含酶的部位呈紫蓝色区带。置7% HAc中保存。
