一、磷脂酶A2的分离纯化
现在已经从四科不同种类的蛇毒中分离出多种磷脂酶a2(pla2)，有些已经得到了 结晶。和蛇毒其他组分相比，PLA2的分离要简单些，很多情况下先经SephadexG-50或 SephadexG-75凝胶过滤，然后过DEAE-Cellulose或CM-Cellulose柱即为纯品。虽然有 多种纯化这种酶的方法，但总得率都不高,一般为20%〜30%。最近有两种新方法可以纯 化这种酶，一种是亲和层析法，该方法用Rac-l-(9-羧基)壬基-2-十六烷基甘油-3-磷酯酰 胆碱与HA-Sepharose 4B通过羧基相联而制成亲和载体（称为PC-Sepharose 4B）。
另一种方法是先用异丙醇(50%)把蛇毒中的大部分蛋白沉淀除去，然后用氯化铷沉 淀PLA2，沉淀的PLA2经过DEAE-Cellulose层析柱进行纯化。这种方法简单，总得率高， 所以比前种方法优点多。
1.亲和层析法一切操作都在5°C下进行。把柱（0. 9cmX15cm)用5ml PC- Sepharose 4B 填充，用 10 倍柱体积的 Buffer I 洗，Buffer I 含 50mmol/L pH7. 5 Tris- HC1、25mmol/L CaCl2、0. 2moI/L NaCl 和 lmmol/L EDTA，柱的加样量为 lOmg 的东 部菱斑响尾蛇粗毒，粗毒用2ml Buffer I溶解，样品加到层析柱后流下 2. 5ml时停止，放置2h。用5倍柱体积的Buffer I洗，接着用5倍柱体积的Buffer I洗， Buffer n 含有 50mmol/L Tris-HCl 和 50mmo丨/L EDTA pH7. 5。洗脱时流速为 15ml/h， 每管1. 0ml对各管的A28。和PLA2活性进行测定，如图3-13-20所示。
这种方法得到的PLA2是由二种异构体组成的混合物，如果想把这种组分中的两种 PLA2分开，可以用DEAE-Cellulose柱层析。这两种酶的得率为90%，用凝胶电泳证明为 纯品。
2.异丙醇沉淀把5g东部菱斑响尾蛇粗毒溶于250ml 0. 05mol/L醋酸缓冲液中，缓冲液pH为5. 25,含有10mm0l/L CaCl2。向这种溶中加250ml异丙醇， 边加边搅拌，加的时间控制在30min。力卩完后在4°C下50 OOOr/min离心30min,上面稍混浊 的溶液保留，下面沉淀弃去。向保留的混浊液中加10ml 0. 5m0l/L NaCl(含0. 05mol/L醋酸 缓冲液），混合后放置30min。按上述相同的条件离心，上清液弃去，沉淀用50ml 0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8. 0含0. Olmol/L EDTA)溶解。对该缓冲液透析48h，每18h换一次缓 冲液。把透析后的溶液离心，超过滤浓缩至l0ml。浓缩后的酶液上DEAE-Cellulose柱，柱内 凝胶预先用0. 05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8. 0 lmmol/L EDTA)平衡。用指数曲线进行 洗脱，使用有三个容器的梯度仪，前二个容器每个含有400ml 0. 05mol/L Tris-HCl缓冲液 (pH8. 0)，含 1. Ommol/L EDTA 0. 02mol/L NaCl; 第三个容器含有 400ml 0. 05mol/L Tris-HCl 缓冲液(pH8. 0)，含 lmmol/L EDTA 0. 2mol/L NaCl，洗脱时流速为 50ml/h，用 泵维持恒压，每管收集5ml，测定每管的A28。值，如图3-13-21所示。
用这种方法可以把东部菱斑响尾蛇蛇毒中的两种PLA2分开，且这两种PLA2和用亲和层析法分离得到的PLA2性质相同。
二、拟箭毒神经毒素的分离
一般地说，可以直接通过离子交换分离这类毒素，有时配合使用凝胶过滤效果更好。 原则上各种阳离子交换树脂都可以使用，但Bi0-Rex-70(也称Amberlite IRC-50)效果更 好。这里介绍一些较好的方法，供参考。
选择凝晈颗粒小于400mesh的Bio-Rex-70。由于该胶有极高的交换能力，所以使用 时平衡时间比其他树脂都要长。由于羧基的含量大，要10倍柱体积的缓冲液通过柱后平 衡才基本完成，这一点和以纤维素或Sephadex为载体的离子交换胶不同，后者所需的平 衡液较少。实验中把Bio-Rex-70胶悬于5倍〜10倍体积0. 2mol/L的醋酸铵溶液中，用2mol/L的氨水或醋酸滴定到PH6. 5或pH7. 3。倾去上层溶液，重复上述过程2次〜3 次，直到加醋酸铵后PH改变小于0. 05个单位为止。这种精确的平衡是以后取得较好实 验结果的基础。用醋酸铵作为洗脱液，胶的本身就是一个强的缓冲液，PH为6. 5,流出的 溶液pH反映了胶被平衡的情况。当PH低于6. 0时，拟箭毒神经毒素不可逆地吸附到 Bio-Rex-70胶上。醋酸铵易挥发，易在冷冻干燥时除去，它还可以提高毒素的溶解性。
Karlsson等（1971)描述了从亚洲眼镜蛇知)蛇毒中提取拟箭毒神经毒素的过程，用简单的Bio-Rex-70离子交换就可以分离出纯品或接近纯品(杂质含量低于3%)。 这种杂质可以通过Sephadex G-50凝胶过滤除去。这种神经毒也可以用磷酸纤维素、 Sephadex G-50和竣甲基纤维素来分离。
三、激肽释放酶的纯化
许多蛇毒中的激肽释放酶都得到了纯化。纯化过程多用DEAE-Cellulose CM-Cellu- lose，或羟基磷石灰柱反复层析以除去激肽酶(破坏激肽的酶)和其他的精氨酸酯酶。大多 数蛇毒都含有二种激肽释放酶，这两种酶可以用Sephadex G-75或DEAE-Cellulose柱分 开，二者的区别不清楚，其中一种分子量可能较小。从日本蝮蛇蛇毒分离激肽释放酶的方法如下。
用pH7. 0,5. Ommol/L醋酸钠缓冲液溶解粗毒，浓度为100mg/ml，离心除去不溶物。 DEAE-Cellulose柱(3cmX 40cm)用同样的缓冲液平衡，蛇毒溶液上柱后用穹形洗脱梯度 进行洗脱，混合瓶为1L平衡液，贮存瓶为0. lmol/L醋酸钠缓冲液，pH为7. 0,洗脱一段 时间后换成0. 2mol/L pH7. 0的醋酸钠缓冲液，然后再换成0. 5mol/L PH7. 0的醋酸钠 缓冲液。洗脱时流速为25ml/h，每管9. 5ml，在4°C下收集，激肽释放酶在 第91〜 第120 管内。对激肽释放酶进行冷冻干燥浓缩至l0ml Sephadex G-75柱(2. 5cmX40cm)脱盐。
CM-Cellulose柱用5. 0mmol/L醋酸钠（pH6. 0)缓冲液平衡，脱盐后的酶液上柱 (1. 5cmX32. 5cm)用直线梯度进行洗脱，类凝血酶先被洗下来，接着下来的就是所需的组 分。该组分不含内肽酶、L-氨基酸氧化酶、PLA2、透明质酸酶、磷酸二酯酶和NAD核苷 酶。纯化的激肽释放酶的精氨酸酯水解活性占蛇毒总精氨酸酯水解活性的10%以上。用 这种方法最后洗下来的组分是具有促凝活性的物质，如图3-13-22所示。
