蛇毒蛋白的分离技术SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

(—)原理

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中迁移率受它的静电荷量与分子大小因素的影响。如果两 种不同分子量的蛋白质分子大小的差异被电荷量的差异补偿时，则这两种不同分子量的 蛋白质可以以相同的速度向阳极移动。由于这个原因，利用一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳方 法是不能测得分子量的，为了解决这个问题，Shapiro等曾试图在有十二烷基磺酸钠(SDS 种阴离子去污剂）存在的情况下分离蛋白质的混合物，在他们最初努力的结果的基础上,Weber和Osborn用同法测定了约40种蛋白质的迁移率，并凭经验观察到， 这些蛋白质的迁移率与它们的分子量的对数成直线关系。

现已证明，十二烷基磺酸钠能与蛋白质的疏水区相结合,并把绝大部分蛋白质分离成 它们的组成亚单位(亚基），SDS的结合还使变性的、随机盘曲的多肽链得到大量负电荷， 这种电荷基本上掩盖了无SDS存在时正常就有的任何电荷。尽管这一技术为什么会这样 成功的确切原因尚不清楚，但是人们已根据经验广泛地利用它来测定纯化蛋白质的分子 量及其亚基的组成。

(二）操作方法

现在常用SDS-凝胶电泳的缓冲系统有几种，其中有连续系统的，也有不连续系统的。 Shapiro和Weber等人最早采用的标准SDS-磷酸盐连续系统，是其中较简单的一种，且 具有一定的分辨能力，能满足许多实验的要求，近年来应用很广。

贮液及凝胶的配制贮液及凝胶溶液的配制方法如表3-13-12。

SDS-凝胶电泳可采用垂直柱型，也可采用垂直_，此处以垂直柱型为例进行叙述。

将凝胶玻璃管插入电泳槽上槽底部的圆孔中，使其垂直。玻璃管底部套上小玻塞，套 前在小玻塞的表面均匀地涂一薄层50%甘油。

由冰箱取出的贮液平均到室温后，按表3-13-12中10%凝胶的比例混合，混合液置真 空干燥器中用水泵抽气lOmin后，加入10%过硫酸铵溶液，混匀后立即用细滴管将胶液 加到凝胶玻璃管中，凝胶高度为7cm，尽量使每管凝胶高度一样(事先画好刻度），加完胶 后立即用带有细针头的注射器沿管壁轻轻向胶面加入蒸馏水3mm〜4mm高，静置数分 钟后，水胶界面消失，20min〜30min重新出现界面，再放置30min即可加样。

制胶时必须注意，向胶液表面加蒸馏水时，切忌水成滴坠入，而应沿着管壁缓慢流下， 否则，顶部凝胶浓度会有较大的稀释，这将影响样品的迁移率而降低测定结果的准确度。

2.样品的制备一般是将蛋白质溶解在含1%SDS、1%巯基乙醇的0. Olmol/L pH7. 2 的鱗酸盐缓冲液中，在100'c加热2min~5min。蛋白质的最后浓度为0. 5mg/ml〜lmg/ml。

表3-13-12贮液及凝胶溶液的配制

表中Acr:丙烯酰按;Bis:甲撑双丙烯酰胺;TEMED:N,N,Nf ,N'-四甲基G二胺 注：贮液置冰箱保存;SDS在低温下析出，使用前微温使其溶解；贮液IV每2周新配一次也可以将上述溶液在37"C保温2h而不是100€加热。一般说来，两种处理的效果都 一样。但如果蛋白质样品中混有少量蛋白水解酶，37X：处理就会引起样品水解，使测定失 败，而10CTC加热3min —般都能使蛋白酶失活，得到满意的结果。也有少数例外的情况， 需要采用特殊的样品处理方法。

标准蛋白质样品的制备:称取细胞色素C、胰凝乳蛋白酶原A、胃蛋白酶、卵清蛋 白、牛血清清蛋白各0. 2mg左右，分别放入小试管中，按0. 5mg/ml溶液的比例，向样品 中加入“样品溶解液”(见试剂的配制），使充分溶解，轻轻盖上木塞(不要塞紧，以免加热时 迸出），将小试管放入沸水浴中加热3min,取出冷至室温。

待测蛋白质样品的制备:固体样品的制备与标准蛋白质相同。如待测样品已在溶 液中，可先配制“浓样品溶解液”(各种溶质的浓度均比“样品溶解液”高一倍），将待测液与 “浓样品溶解液”等体积混匀，然后同上加热。若待测溶液太稀可事先浓缩;若溶液含盐量 太多则必须先行透析。

处理好的样品溶液即可用于电泳。对于直径为6mm的凝胶柱，每管加lOfxg蛋白质 (或更少一些)便可得到清晰的区带。根据样品溶液的浓度，加样体积可以1(^1〜15(^1。

处理好的样品溶液可在冰箱中保存较长时间，使用前在10CTC水浴中加热lmin，以除 去可能出现的亚稳态聚合物。

电泳轻轻取下凝胶管底部的小玻塞，注意保持玻管垂直装置在电泳槽上。将电泳 槽的上槽倾斜过来，使凝胶管口斜向下方，用滴管轻轻吸去流到凝胶管口的水。将电极缓 冲液注入下槽，将上槽轻轻放下，稍微转动，以除去凝胶管底部可能有的小气泡，也可用带 弯头的滴管轻轻吸去。

将电极缓冲液注入上槽，没过管口。

用微量注射器按号向凝胶管中加样，每管加一种样品，各加20/xK含蛋白质10叫），稀 溶液最多可加150/J。

加样完毕，打开直流稳压电源(负极接上槽，正极接下槽，事先都接好），将电流调至每 管8mA。保持电流强度不变，待染料(染料已事先加在“样品溶解液”中)迁移至距下口约 lcm处，停止电泳，需时4. 5h〜5h。

染色、脱色用带有细长针头的注射器吸满蒸馏水，插入凝胶与管壁之间，一面轻 轻旋转玻璃管，一面推针前进，并注入蒸馏水，使凝胶剥离玻管并滑出。在染料区带的中心 插入细铜丝作为标志，按编号加入试管，加入染料液，染色4h或过夜。次日，倾出染色液， 用蒸馏水洗凝胶数次后加入脱色液，数小时换一次脱色液，直至背景清.