蛇毒蛋白的分离技术具体操作

随着近代科学技术的发展，液相色谱技术逐渐地推广应用到化学的各个领域中去了。 应用范围可以分为三个方面：①制备色谱；②定性分析；③定量分析。

在HPLC中进行样品分析的主要步骤：

(—)进样前的准备工作

首先使用的溶剂，即流动相要求具有较高纯度。有机溶剂事前必须重蒸；用水要经 过混合离子交换树脂处理和活性炭处理后，重蒸除去各种杂质才能使用。盐类常必须经 过重结晶。

各种溶剂一般要求新鲜配制，使用前经过脱气处理。

挥发性有机溶剂脱气较长，方法是超声波振荡。水和缓冲液先通过微孔薄膜滤去固 体微粒后，缓慢加热搅拌（在电磁搅拌器上），抽真空去气。

样品加入前，必须用流动相充分洗柱，待流出液经过检测器的基线校正，证明柱内 残留杂质确已全部除净，才能进样。

进样时，样品用与流动相相同的或互溶的溶剂完全溶解，如有悬浮状颗粒，需过滤 除去，然后通过注射器或进样阀进样。进样量的多少视不同的柱容量而定，一般制备性 柱每次较大上柱量可达l0mg〜1 OOOmg

(二）洗脱

进样后洗脱的条件常按事先计划好的溶剂程序进行，内容一般包括：

每次色谱计划所需时间。

 洗脱液（即流动相）的组分（单元或多元）及对形成梯度的要求。如样品各组 分与固定相之间的亲和能力差别较大时，采用梯度洗脱方法（包括极性、PH和离子强度 的改变）可以获得较好的分离效果。

流动相的流速，是恒速或变速或每分段时内要求流动相的流速。

实际上，样品展层以后所得色谱图一次很难获得良好的分离效果，需要根据色谱图 各组峰形状、位置进行综合分析，并按自己所需制备的组分的谱峰分离情况，调整流动 相的极性（或离子强度）梯度组合、流速及展层时间等。一般现代高效液相色谱仪都有 自动控制程序装置，再加上检查温度和pH对分离的影响，直至选择到较好的分离条件 后，便开始大规模分离，收集所需的组分。

各类色谱柱加进样品后如何选择适应的洗脱液（即流动相）的基本原理与经典色谱 洗脱法大致相同。例如液液分配色谱的正相与反相色谱的操作原则大致如表3_13_8。

表3-13-8正相与反相色谱操作原则

当然，高效液相制备色谱对流动相的要求需照顾到与检测器相匹配，同时还要尽可 能获得较大的分离度，因此，使用有机溶剂时要求粘度要低并有一定挥发度。其中最常 用的有机溶剂有乙腈、甲醇、二氯甲烷、己烷、硝基丙酮等。有些工厂生产的色谱柱还 限定不准使用某种溶剂，则应注意遵守。

(三）色谱柱的清洗及保存

色谱分离完毕后，应用溶剂彻底清洗色谱柱，色谱柱用后存放时间过久也应定期清 洗。硅胶柱先用甲醇和乙腈冲洗（乙腈价格较贵，可少用，多用甲醇），再用干燥的二氯 甲烷清洗后保存。烷基键合相色谱柱可用甲醇一氯仿一甲醇一水顺次交替冲洗除去有脂 溶性及水溶性杂质。离子交换柱可按一般经典方法经过酸碱缓冲液平衡后，再以水和甲 醇洗净。凝胶柱则根据其使用流动相的不同分别以甲苯、四氢呋喃、氯仿或水大量冲洗 干净。但亲水性凝胶及其他亲水性色谱柱保存时，常加入少量甲苯或氯仿以防止微生物 污染。