治疗用抗蛇毒血清的制备

目前世界上已有20多个国家30多个单位生产60多种治疗用的单价、双价和多价抗蛇毒 血清，计100多种，它是目前公认的治疗蛇伤的有效药物。药用抗蛇毒血清的制备在原理和基 本方法上与实验室研究用的抗蛇毒血清相似，但在选择动物和抗原等方面有些差异，这里就有 关差异的问题作些简单的介绍。

抗原的选择与制备用作抗原的蛇毒一般选分布广、伤害人多、死亡率高并具有 抗原谱广(即具有区域代表性)的毒蛇蛇毒。这样的蛇毒制取的抗蛇毒血清不但能中和该 蛇毒，而且能中和其他相似毒蛇的蛇毒，具有很高的应用价值和经济效益。一旦选择好了 使用的抗原，下一步就应该对此制备蛇毒。用作抗原的蛇毒一般应由专人提取，商品蛇毒 往往因混有其他蛇毒或杂质而影响抗血清的制备。一般选择健康毒蛇，以咬皿挤压法采集 蛇毒，新鲜毒液经2 500r/min离心20min，取上清液冰冻干燥成粉状后备用。给动物进行 免疫之前，蛇毒必须经除菌处理，因为蛇毒经毒蛇的口腔排出时，常被一些致病微生物(如 葡萄球菌、链球菌、破伤风梭状杆菌和气性坏疽杆菌等以及脑炎病毒)污染。蛇毒是一种复 杂的混合物，一种蛇毒约含有5种〜15种酶，3种〜12种非酶蛋白和多肽以及至少6种 其他物质。同时，与毒性相关的往往是蛇毒中对热稳定的低分子量多肽，这类物质的抗原 性较差，若加大免疫剂量以增强免疫动物的刺激性，在免疫过程中会造成动物死亡。这个 问题可由两种方法解决，一是对抗原加佐剂以提高免疫作用；二是对抗原做减毒处理，使 之能用较大的剂量免疫动物而不会引起动物死亡。常用的佐剂有福氏佐剂、可溶性淀粉、 南洋面包木薯粉、可溶性羧甲基纤维素、氢氧化铝凝胶和海藻酸钠等。在制备抗蛇毒血清 时一般采用不完全的福氏佐剂，即羊毛脂和石蜡油。佐剂能增强免疫作用，一般认为它具 有推迟抗原的排泄、延长抗原刺激机体的时间，更主要的是它能激发网状内皮系统组织细 胞的增生，促进巨噬细胞的活力，因而能提高机体的免疫反应。抗原的减毒方法很多，目的 是减低抗原的毒性但不改变或基本不改变抗原的抗原性。在光氧化减毒、过氧化、氢氧化 减毒和福尔马林处理减毒等方法中，福尔马林处理减毒效果较好。在一'定浓度下，用福尔 马林处理2周，可使毒蛇的毒性大部分丧失而抗原性基本不变，这在免疫过程中将会得到 较为满意的效果。

动物免疫制备抗蛇毒血清用的动物可选用马或羊，最早有用羊为实验动物的， 但现在制备商品抗血清全都用马。这是因为马体型大，采血量多，易饲养，同时对蛇毒抗原 比较敏感。对马的选择主要是体型大而健壮，其他条件都是次要的。选择好的马需经过检 疫，因为有的马带有某种病菌，这样的马血清注入人体会带来不良的后果。

关于如何免疫动物才能获得好的效果，这与多种因素有关，各家都有自己的经验。一 般马经免疫后可多次放血，每次放血后再进行适当的免疫。对马初次免疫和采血后再免疫 的方法不同，初次免疫时常常分两步进行，即先给免疫动物注射少量的蛇毒后，让动物休 息2个月左右再进行正式免疫,剂量逐渐加大，每次间隔1周，直至免疫成功为止。对于注 射部位、免疫程序、抗原剂量、采血量、休息时间和马匹选择等都是应注意的重要因素。

马经免疫一段时间后，从颈静脉采取血样，测定血清(或血浆）的效价。测试数次后，若 试血结果已经达到要求的效价，则可于末次注射后数日内（通常1周）采血。试血的一般要 求为lml血清加lml含不同剂量蛇毒（LD5。或MID)，混合后在37°C放置45min〜60min 后注射到体重20g的小鼠体内，以动物不死的蛇毒较高剂量为该血清试血效价，达到要求 效价水平，才可放血。放血从马颈静脉进行，以柠檬酸钠为抗凝剂。放血量的多少可根据 马体型的大小而定，一般可以放出8L〜10L血，隔3天可以再放一次血，以后休息。血液 经离心后分离出红细胞，血浆加防腐剂保存在2C〜lO'C暗处，自分离之日起至少要贮存 1个月，方可用于制备抗蛇毒血清。血细胞可以丢弃不用，也可以重新送回到原马的体内， 这样可以使马快速恢复健康，缩短          第二次采血的时间，但工作量较大，要无菌操作，否则会 给实验动物带来危害。

抗血清的提纯马血浆中含有多种蛋白质，这些蛋白质的含量很大，而有效成分 却较少。马血浆中的蛋白质属于异体蛋白，进入人体的量如过多就会使人产生不良反应, 如血清病和过敏反应等。另一方面，不加处理的血浆由于蛋白成分太多，容易变质，不易贮 存。现在一般的做法是对血浆进行提纯处理，提取出有效的免疫球蛋白IgG。不但如此，还 采用胃酶消化除去IgG分子中无中和毒素作用的Fc部分。抗蛇毒血清的提取方法基本 采用破伤风抗毒素生产方法，即采用胃酸消化、硫酸铵沉淀、明矾吸附等工艺，其工艺过程 分以下几步：

(1)消化加温:将免疫血浆稀释2倍〜3倍调至适宜的pH后，加入一定量胃蛋白酶和 甲苯，在一定温度下作用一定时间，然后加入15%硫酸铵，pH调至5. 0左右，加温至57€ 〜58'C 30min，冷却过滤，取滤液。